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浅析酵母双杂交文库构建的方法

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发表于 2018-6-7 09:11:35 |显示全部楼层
酵母双杂交技术是分子生物学研究领域的重要实验手段,是利用酵母遗传学方法来分析蛋白质之间的相互作用,现在已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。酵母双杂交文库构建一般包括核体系和膜体系两种方法。

核体系包含通过同源重组的方式实现文库的构建、根据Gateway的技术实现建库采用BP重组和LR重组分别获得初级文库与次级文库这两种方法。膜体系是由酶切连接的方法实现建库,主要是基于分离的泛素介导膜蛋白互作信号的识别。美迪西生物医药专业从事酵母双杂交,出具权威检测数据报告,具有独立优质实验室,专业实验人员,提供详细的酵母双杂交实验步骤,原始数据和图片,结果分析。

1、膜体系和核体系酵母双杂筛库的不同点

筛库所用菌株不同,在通过共转方式筛库时,核体系使用Y2HGold酵母菌,膜体系使用NMY51菌株。核体系除了可以选择共转筛库,还可以通过mating的方法进行。Mating自然要用到两种性别的菌株,含有AD文库质粒的Y187和含有BD质粒的Y2HGold。

2、核体系和膜体系在整个实验的流程上的差异。

值得注意的是核体系酵母双杂中如果BD基因本身为转录因子时,可能存在自激活现象,因此在诱饵载体构建完成后首先要做的则是诱饵基因的自激活检测。而膜体系酵母双杂,理论上由于诱饵蛋白被“挂”在细胞质膜上,在没有互作蛋白相互靠近时,泛素的两部分彼此分离,转录因子不会被切割,便不会导致报告基因表达。而对于膜体系酵母双杂,因为诱饵蛋白在细胞膜上的跨膜方式不同,构建BD载体时选用的质粒不同。基于此,在BD载体构建完成后,首先要做的是功能验证,亦即所构建的BD质粒是否适用于该系统。
在阳性克隆的筛选方法上两者亦不同。

核体系,因为报告基因中有MEL1,在有蛋白互作时,α-半乳糖苷酶被表达,即在含X-α-Gal的选择培养基上阳性菌落呈蓝色。膜体系中,主要是通过报告基因ADE2的表达程度来筛选阳性克隆。无相互作用蛋白时,腺嘌呤合成被阻,中间产物积累,细胞变红,克隆表现出从开始生长至时间延长由浅粉变为暗红色。有蛋白相互作用时,克隆颜色由于作用强度不同,ADE表达量不同,克隆呈现粉白(弱相互作用)至白色(强相互作用)。

如何确定是选择构建核体系文库还是膜体系文库

如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库,如果诱饵基因是定位于核则选择核体系文库,如果诱饵基因有跨膜区也可以考虑把跨膜区切除以后用核体系文库筛库,但是这样操作有一定风险。酵母双杂交系统具有发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用、筛选药物的作用位点、建立基因组蛋白连锁图等功能,其应用也会越来越重要。

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