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蛋白质修饰研究的最新篇章

2018-9-28 18:06| 发布者: 药学助手| 查看: 103| 评论: 1|来自: 本站原创

摘要: 蛋白质修饰的重要性蛋白质是执行细胞功能的基本功能单元,其表达受基因组和表观遗传学的调控。通常,蛋白质在表达以后还需要经过不同程度的修饰才能发挥所需要的功能。这种翻译后修饰过程受到一系列修饰酶和去修饰酶 ...



蛋白质修饰的重要性

蛋白质是执行细胞功能的基本功能单元,其表达受基因组和表观遗传学的调控。通常,蛋白质在表达以后还需要经过不同程度的修饰才能发挥所需要的功能。这种翻译后修饰过程受到一系列修饰酶和去修饰酶的严格调控,使得在某一瞬间细胞中蛋白质表现出某种稳定或动态的特定功能。蛋白质翻译后修饰(PTM)通过共价添加官能团或蛋白质,调节亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解来增加蛋白质组的功能多样性。

这些修饰包括磷酸化,糖基化,亚硝基化,甲基化,乙酰化,脂化和蛋白水解,并且影响正常细胞生物学和发病机理的几乎所有方面。蛋白质磷酸化是迄今为止最常见的PTM,已在大约17,500种人类基因产物中检测到。翻译后修饰是增加蛋白质组多样性的关键机制。尽管基因组仅包含20,000至25,000个基因,但估计蛋白质组包含超过100万个蛋白质。转录和mRNA水平的变化增加了转录组相对于基因组的大小,并且无数的不同翻译后修饰指数增加了蛋白质组相对于转录组和基因组的复杂性。因此,识别和理解PTM对细胞生物学和疾病治疗和预防的研究至关重要。
 
 
 
(蛋白修饰3d示意图)
 
蛋白质修饰研究进展

基于翻译后修饰蛋白质的不均一性及相对丰度低的特性,翻译后修饰蛋白质的研究主要是利用现有的蛋白质组学技术体系包括电泳、色谱、生物质谱以及生物信息学工具,对修饰蛋白质或肽段进行富集分离,消除修饰引起的不均一性并标记修饰位点,使之与理论质 量有一个差异,通过质谱检测这种差异,从而鉴定蛋白质,并通过串联质谱鉴定修饰位点。PTMs 广泛存在于真核细胞生物中,对生物体的信号传导以及生命活动至关重要,但是 PTMs 鉴定往往比未修饰多肽 鉴定更加困难。
蛋白磷酸化修饰是生物体内最为普遍也是研究最为深入的修饰方式,而其中的酪氨酸磷酸化,特别是酪氨酸激酶受体的磷酸化已经被证明对癌细胞的诱发和生长有关键作用,多种针对不同酪氨酸激酶受体的小分子抑制剂和单克隆抗体也已经被开发成为治疗癌症的一线药物。目前研究较多的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化四类修饰。
 

(基本修饰类型)

磷酸化的研究方法及关键技术有:免疫沉淀法、流式细胞分析、双向凝胶电泳法、固相金属亲和色谱等。针对乙酰化主要的研究方法有:生物质谱鉴定乙酰化修饰位点、基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体鉴定乙酰化修饰位点、以标记底物为基础的方法鉴定乙酰化修饰位点等。针对甲基化主要的研究方法有:甲基化特异性的 PCR、亚硫酸氢盐测序法、高分辨率熔解曲线法。


而糖基化的研究方法及关键技术有:放射性标记法、分子荧光标记法、电泳法、凝集素标记法、抗体标记法、化学酵素法等。目前所具有的对泛素蛋白探究的技术类型比较单调。对泛素蛋白的检测、泛素作用靶点的定位以及泛素蛋白本身性质的探究方法中,这些技术还必须进行不断的改进和完善。譬如,传统的蛋白质翻译后修饰研究主要依赖于基于特异性抗体的免疫检测技术或放射性标记技术。这些方法对研究由单一位点翻译后修饰介导的细胞信号转导过程起着不可替代的作用。然而,由于上述技术存在操作要求高、特异性抗体制备周期长等缺点,很难实现蛋白质翻译后修饰的大规模检测。


蛋白质修饰检测技术进展


近年来,基于液相色谱与生物质谱联用技术( LC-MS) 的蛋白质组学策略发展迅速,为系统水平上的蛋白质翻译后修饰研究提供了强有力的研究工具。且基于质谱的蛋白质组学大大扩展了人们对蛋白质翻译后修饰(PTM)的发生和动态的了解。到目前为止,定量蛋白质组学主要用于研究细胞培养模型中的PTM调控,为异常PTM模式在人类疾病中的作用提供新的见解。质谱库已被广泛应用于准确研究各种蛋白质定量分析,在定量已知蛋白质的应用研究中尤为突出。


(仪器设备)

目前,利用单克隆基序抗体对含有PTM肽段进行免疫亲和富集并联合液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析的PTMScan新技术策略在多种翻译后修饰研究中引起了关注。PTMScan技术的基本操作方法包括利用9M 尿素裂解液,对疾病细胞系或患者组织块(足够提 取10 mg蛋白)进行裂解获取蛋白裂解物,经过蛋白内切酶(通常使用胰酶)消化后获得蛋白肽段混合物,利用C18纯化柱对肽段混合物进行纯化,然后利用CST公司独有的蛋白质翻译后修饰motif抗体分别对含有不同蛋白后修饰的肽段进行亲和富集并纯化,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行半定量分析。


此外生物信息学的分析方法也在PTM研究领域取得进展,近年来,随着蛋白质组学技术的发展,基于蛋白质组尤其是修饰蛋白质组学数据的生物信息学研究可以对翻译后修饰提供整体和更深层次的认识。1999 年,丹麦生物序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis, CBS)的 Nikolaj Blom等使用当时已知的、实验证实的 210 个酪氨酸 (Tyrosine)、584个丝氨酸(Serine)和108 个苏氨酸 (Threonine)磷酸化位点作为训练集,利用神经网络 (Neural network) 算法首次实现了非特异性的 (Non-specific)蛋白质磷酸化位点的预测。此后类似实验逐渐开展,陆续研究逐渐问世。国外一项比较小鼠正常皮肤与皮肤癌组织的工作中,结合定量蛋白质组与定量磷酸化组数据,通过比较发现 47.3%的蛋白质在蛋白和磷酸化水平都受到调控,而超过一半的蛋白质仅在磷酸化水平受到调控。可以预见计算与实验合作, 通过实验学的方法验证或至少部分验证预测结果,已成为领域的研究趋势。
 

(生物信息学解码蛋白修饰)

将于2018年10月26至27日,在上海举办2018蛋白质修饰与疾病研讨会。此次会议将邀请该领域的国内专家,围绕蛋白质修饰的种类方式、作用机制,与疾病及药物研发的关系等,从不同角度和层面呈现蛋白质修饰的基础研究、调控方法、检测手段、分析技术等最新进展,为与会者提供一个前沿的交流平台,促进基础研究向实际应用转化。欢迎大家过来与会交流。
 
会议官网:http://meeting.bioon.com/2018promd 

1. 刘婷, 马铖杰, 袁必锋,等. 修饰组学:解析修饰生物分子功能[J]. 中国科学:化学, 2018(5).
2. 李振亚, 顾宏博. 翻译后修饰蛋白质组学研究的新技术策略[J]. 生命的化学, 2014, 34(2):000214-220.
3. 唐佳. 基于功能化材料的磷酸化与糖基化蛋白质高效富集及鉴定新方法研究[D]. 复旦大学, 2010.
4. 林琳, 罗树生, 王灵珏,等. 色谱与质谱联用技术在蛋白质翻译后修饰研究中的进展及应用[J]. 分析化学, 2015, 43(10):1479-1489.
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